【阿拉丁】固相多肽合成——高效策略,革新技術(shù)
固相多肽合成——高效策略,革新技術(shù)
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? ? ? ? ?固相肽合成技術(shù)(SPPS)是一種革命性的生物化學(xué)技術(shù),自20世紀(jì)60年代問世以來,已成為合成肽和蛋白質(zhì)的主要方法。1963年,羅伯特·布魯斯·梅里菲爾德(Robert Bruce Merrifield)首次提出了固相肽合成的概念,這一突破性工作不僅極大地提高了肽合成的效率和可控性,還為他贏得了1984年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
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? ? ? ? 在固相肽合成中,肽鏈的生長(zhǎng)是通過逐步加入氨基酸單體來實(shí)現(xiàn)的。與溶液相合成不同的是,固相肽合成中,肽鏈被固定在一個(gè)不溶性樹脂載體上,這樣可以簡(jiǎn)化反應(yīng)后的純化步驟。合成過程從C端氨基酸開始,通過在其α氨基上連接到樹脂載體上,然后依次將保護(hù)好的氨基酸逐一連接到生長(zhǎng)中的肽鏈上。每次氨基酸連接完成后,通過簡(jiǎn)單的過濾步驟去除反應(yīng)中未反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物,從而減少了傳統(tǒng)溶液相合成中需要復(fù)雜純化的步驟。
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? ? ? ? SPPS的核心在于兩個(gè)主要步驟:脫保護(hù)和偶聯(lián)。首先,肽鏈上的保護(hù)基團(tuán)被移除,使得下一個(gè)氨基酸能夠結(jié)合到肽鏈的游離氨基上。常用的脫保護(hù)試劑包括三氟乙酸(TFA)和二異丙基乙胺(DIPEA),這些試劑能夠有效去除保護(hù)基而不損壞肽鏈。脫保護(hù)后,氨基酸被活化以便偶聯(lián)到生長(zhǎng)中的肽鏈上。常用的偶聯(lián)試劑包括HBTU、HATU等,它們能夠促進(jìn)氨基酸與肽鏈上的游離氨基形成肽鍵。
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? ? ? ? SPPS的主要優(yōu)勢(shì)在于其高效性和自動(dòng)化潛力。現(xiàn)代的自動(dòng)化合成器可以在短時(shí)間內(nèi)合成數(shù)十個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽鏈,使得合成復(fù)雜肽和小型蛋白質(zhì)變得可行。此外,由于合成是在固相載體上進(jìn)行的,反應(yīng)物和副產(chǎn)物可以通過簡(jiǎn)單的洗滌步驟被除去,這大大簡(jiǎn)化了后期的純化步驟。
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? ? ? ? 在SPPS的發(fā)展過程中,出現(xiàn)了兩種主要的技術(shù)流派:Fmoc和Boc策略。這兩種方法的區(qū)別在于它們使用的氨基酸保護(hù)基團(tuán)和脫保護(hù)條件。Fmoc策略使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為保護(hù)基,脫保護(hù)時(shí)使用堿性條件,如哌啶,而Boc策略使用叔丁氧羰基(Boc)作為保護(hù)基,脫保護(hù)時(shí)使用酸性條件,如三氟乙酸。Fmoc策略由于其溫和的脫保護(hù)條件和較少的副產(chǎn)物形成,逐漸成為主流。
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? ? ? ? Boc策略是最早發(fā)展的固相肽合成方法之一,它使用叔丁氧羰基(Boc)作為氨基保護(hù)基團(tuán)。在每個(gè)氨基酸殘基的連接過程中,Boc基團(tuán)通過酸性條件(通常是三氟乙酸)去保護(hù),暴露出氨基以進(jìn)行下一步的肽鍵形成。與Boc策略相比,F(xiàn)moc策略的開發(fā)則是在為了避免酸性條件對(duì)肽鏈的潛在損傷的背景下提出的。Fmoc策略采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為保護(hù)基團(tuán),利用堿性條件(通常是哌啶溶液)去除Fmoc基團(tuán),從而暴露氨基以進(jìn)行下一步反應(yīng)。
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? ? ? ? 以Fmoc策略為例,首先,在合成開始前需要選擇合適的樹脂作為固相載體,常見的有聚苯乙烯樹脂(例如Wang樹脂或Rink amide樹脂),這些樹脂具有能夠與氨基酸形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)。合成反應(yīng)的第一步是將C端氨基酸固定在樹脂上,通過與樹脂上活化的官能團(tuán)反應(yīng),形成穩(wěn)定的酰胺鍵。接下來,使用20%的哌啶溶液去除氨基酸上的Fmoc保護(hù)基團(tuán),暴露出游離的氨基。然后,加入下一步要連接的氨基酸,該氨基酸通常使用羧基活化劑(例如HBTU、HATU或DIC)進(jìn)行預(yù)先活化,從而促進(jìn)其與前一氨基酸的氨基形成肽鍵。這一循環(huán)過程在合成每個(gè)氨基酸時(shí)重復(fù)進(jìn)行,直到整個(gè)多肽鏈合成完成。每次反應(yīng)結(jié)束后,合成過程中使用的溶劑(如DMF、DCM)和副產(chǎn)物都可以通過簡(jiǎn)單的洗滌步驟去除。
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? ? ? ? Boc策略的合成流程雖然與Fmoc策略類似,但其細(xì)節(jié)有所不同。Boc策略首先也是將C端氨基酸與樹脂載體偶聯(lián),形成酰胺鍵。隨后,通過使用強(qiáng)酸性試劑(如三氟乙酸,TFA)去除氨基酸上的Boc保護(hù)基團(tuán),暴露出游離氨基。然后,加入下一個(gè)Boc保護(hù)的氨基酸,在存在羧基活化劑的條件下,形成肽鍵。與Fmoc策略不同,Boc策略中由于需要使用酸性條件進(jìn)行脫保護(hù),因此其應(yīng)用可能對(duì)某些酸敏感的氨基酸或肽鏈有潛在的影響。盡管如此,Boc策略仍然在一些特定的肽合成中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
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? ? ? ? 無論是Fmoc還是Boc策略,每個(gè)步驟的反應(yīng)條件和試劑選擇都需精確控制,以確保多肽鏈的合成高效且準(zhǔn)確。最終,通過從樹脂上切下肽鏈并進(jìn)行純化,獲得目標(biāo)多肽。兩種策略各自在特定應(yīng)用中展現(xiàn)了獨(dú)特優(yōu)勢(shì),為研究人員提供了靈活而強(qiáng)大的多肽合成手段。
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